با روش Real Time PCR آشنا شوید

 

 

• در این روش از یک مولکول گزارشگر فلوروسنت  برای مشاهده پیشرفت PCR به کار می رود. فلوروسنت  از مولکول گزارشگر ساتع می شود که تولیدات را چند برابر می کند.

به طور کلی Real Time PCR تکنیکی برای مشاهده بی وقفه ی پیشرفت واکنش PCR در طول زمان می باشد. همچنین با این روش می توان مقادیر تولیدات  PCR (DNA,cDNA یا RNA) را نیز اندازه گیری نمود.

این روش بر مبنای فلوروسنت  تولیدی از مولکول گزارشگر (Reporter) می باشد که در طول واکنش افزایش می یابد. مولکول ها ی گزارشگر فلوروسنت یا به صورت رنگ هایی می باشند که به DNA دو رشته ای باند می شوند مانند SYBR® Green و یا بصورت شناساگرهای توالی های خاص مانند TaqMan® Probes می باشند. این تکنیک می تواند با حداقل اسید نوکلئیک آغاز شود و مقدار تولید نهایی را با دقت زیادی تعیین نماید. محدود به زمان و ذخیره منابع نمی باشد، به راحتی قابل اجرا است و دقت و حساسیت بالاتر از PCR معمولی دارد. این روش توانایی تشخیص بسط PCR را در مرحله اولیه واکنش دارد در حالی که تشخیص در PCR معمولی در مرحله نهایی واکنش می باشد.

کلمات کلیدی: Real Time PCR ،  PCR معمولی، شناساگرهای مولکولی.

مقدمه

PCR  مخفف Polymerase chain reaction  می باشد که به معنی واکنش زنجیره ای پلی مراز می باشد. هدف از آن سنتز رشته های  DNA جدید از روی رشته های الگو است که به صورت زنجیر وار تکرار می شود. PCR  دارای انواع متعددی می باشد یکی از آنها  Real Time PCR  است که آن را ( Assay Homogeneos ) نیز می نامند به دلیل اینکه در آن برخلاف روش الکتروفورز اجزای واکنش دهنده PCR از یکدیگر جدا نمی شوند. دراین روش از ژل آگارز استفاده نمی شود و امروزه با دستگاه های به نام لایت سایکلر( Lightcycler) که مقدار محصول در هر سیکل را نمایش می دهد بسیار ساده شده است. در ساده ترین حالت از اتیدیوم بروماید ((EtBr  به عنوان رنگ تداخلی با DNA برای تعیین مقدار محصو ل تولید شده در هرسیکل می توان استفاده کرد. ازانجایی که قابلیت فلورسانس اتیدیوم بروماید در حضور  DNA دورشته ای افزایش می یابد, می توان از ان برای تشخیص وتعیین مقدارمحصول دورشته ای استفاده کرد. اتیدیوم بروماید تقریبا هیچ گونه اثری برروی مقدارو خصوصیات واکنش های  PCR ندارد بنابراین تکثیر توالی های خاص  DNA وتشخیص همزمان ان با دسگاه ترانس ایلومیناتور فرابنفش (UT Transilominator ( امکان پذیر می گردد. در این مقاله هدف, معرفی روش  Real Time PCR وکاربردهای ان  ومقایسه آن معمولی PCR  می باشد.

مراحل ازمایشگاهی  PCR

۱-واسرشت سازی دو رشته  DNA : دراین مرحله DNA دو رشته ای در درجه حرارت بالا(حدود ۹۵ درجه) به منظور به دست اوردن مولکول های DNA تک رشته ای, واسرشت می شود.

۲-هیبریداسیون: در این مرحله توسط پرایمر های الیگونوکلئوتیدی که مکمل توالی DNA تک رشته ای شده هدف می باشند در درجه حرارت حدود ۴۰تا ۶۵ درجه هیبریداسیون صورت می گیرد

۳-طویل سازی(بسط یا سنتز): در این مرحله با یک DNA پلیمراز مقاوم به حرارت مانند Taq پلیمراز در درجه حرارت حدود ۷۲ درجه سانتی گراد طویل سازی رشته صورت می پذیرد.

این مراحل پی درپی تکرار می شوند به طوری که تعداد قطعات  DNA در هر سیکل دو برابر می شوند.به قطعاتی که در هر سیکل به صورت تصاعدی افزایش می یابند آمپلیکون(Amplicon) می گویند.

مراحل نموداری PCR

در هر نمودار PCR سه مرحله قابل تشخیص است:

۱- مرحله نمایی (صعودی): در هر سیکل در این مرحله محصولات مضاعف می شوند.

۲- مرحله خطی: در این مرحله اجزای واکنش در حال مصرف شدن می باشند و واکنش به کندی پیش می رود و طول تولیدات در حال کاهش می باشند.

۳- مرحله پلاتئو: واکنش متوقف شده است بیشتر محصولات ساخته نشده اند و تولیدات PCR رو به تنزل می باشند.

روش کار Real Time PCR

در این روش از یک مولکول گزارشگر فلوروسنت  برای مشاهده پیشرفت PCR به کار می رود. فلوروسنت  از مولکول گزارشگر ساتع می شود که تولیدات را چند برابر می کند. بر مبنای ملکولی که برای تشخیص استفاده می شود این تکنیک به دو روش تقسیم بندی می شود:

۱-تشخیص غیر اختصاصی با استفاده از رنگ های باند شده بهDNA

در اینجا از رنگ های باند شده به DNA به عنوان گزارشگر فلوروسنت برای مشاهده واکنش  PCRاستفاده می شود. این فلوروسنت در سیکل متوالی بر اثر مضاعف شدن افزایش می یابد. با ثبت مقدار فلوروسنت ساتع شده در سیکل، می توان واکنش را در طول مرحله نمایی مشاهده نمود. اگر نموداری میان لگاریتم مقدار شروع واکنش و افزایش فلوروسنت  گزارشگر ترسیم شود یک رابطه خطی مشاهده خواهد شد. اغلب از SYBR® Green به همراه DNA دو رشته ای به عنوان رنگ مخصوص گزارشگر استفاده می شود. این رنگ به شکاف کوچک از مارپیچ دو رشته ای DNA باند می شود. در داخل محلول, رنگ هایی که باند نشده اند فلوروسنت  خیلی کمی را نشان می دهند و فلوروسنت  زمانی به وضوح  افزایش می بابد که رنگ به DNA دو رشته ای پیوسته شود. SYBR® Green تحت شرایط PCR پایدار وبا ثبات باقی می ماند. سطح مطلوبی از درجه حرارت موجب تنظیم القاء و نشر طول موج ها می شود. همان طور که پیشتر ذکر شد از اتیدیوم بروماید نیز برای تشخیص می توان استفاده کرد ولی به علت سرطان زا بودن ان کمتر استفاده می شود.

۲-تشخیص اختصاصی با استفاده از شناساگرهای هدف

در این روش از تعدادی شناساگرهای الیگونوکلئوتیدی استفاده میشود که از رنگ فلوروسنت  گزارشگر به همراه رنگ خاموش کننده) (Quencher استفاده می شود. شناساگرهای مورد استفاده در اینجا شامل Molecular Beacons , TaqMan® Probes , FRET Hybridization Probes  و Scorpion® Primers می با شد.

فعالیت ‘۵ نوکلئاز در تشخیص Real time  به کار می رود. برای سنجش ‘۵ نوکلئاز یک الیگو نوکلئوتید کهTaqMan® Probes نامیده می شود به ترکیب واکنش گر PCR اضافه می شود. شناساگر به منظور گرم کردن توالی خاصی از الگو بین رشته پیشرو و رشته معکوس در حال ساخت طراحی می شود. شناساگر در مسیری از آنزیم که از آنجا نسخه برداری DNA  و یا cDNA شروع می شود قرار داده می شود. زمانی که انزیم به شناساگر گرم شده می رسد فعالیت  ‘۵ نوکلئازی انزیم، موجب شکافته شدن شناساگر می شود. توالی  TaqMan® Probes در انتهای ‘۵ خود رنگدانه ای با انرژی بالا دارد که Reporter (گزارشگر) نامیده می شود ودر انتهای ‘۳ خود یک مولکول با انرژی پایین به نام )Quencherخاموش کننده( دارد. شکل زیر نشان می دهد  زمانی که این شناساگر دست نخورده است وبه وسیله منبع نور القاء می شود، رنگدانه Q  مانع نشر رنگدانه R می شود در نتیجه این عمل رنگدانه ها به هم نزدیک می شوند. هنگامی که شناساگر بوسیله فعالیت ‘۵ نوکلئازی آنزیم شکافته می شود فاصله بین R و Q افزایش می یابد و این موجب توقف انتقال انرژی می شود. القای  فلوروسنت ی R افزایش می یابد در حالی که Q کاهش پیدا می کند.

افزایش سیگنال R بوسیله ابزار تشخیص توالی گرفته می شود و سپس بوسیله نرم افزار نمایش داده می شود. شکل زیر افزایش سیگنال R را بر حسب زمان نشان می دهد. میزان افزایش سیگنال R متناسب با مقدار تولید برای یک نمونه معین می باشد.

: Fluorescent Resonance Energy Transfer –  FRE

FRET در سنجش ‘۵ نوکلئاز استفاده  می شود به این صورت هنگامی که رنگدانه محتوی انرژی بالا به رنگدانه محتوی انرژی پایین نزدیک شود، انرژی از بالا به پایین القا می شود. FRETابزاری برای جمع آوری داده در این تکنیک می باشد.هنگامی که سیگنال R به سطح قابل تشخیص افزایش می یابد می توان ان را مهار کرد و بصورت نمودار نشان داد.نمودار توسعه شامل اطلاعات لازم برای اندازه گیری کمی DNA وRNA می باشد. سطح آستانه (Threshold line ) سطحی از واکنش است که شدت فلوروسنت  در بالاتر از ان قابل تشخیص است. دوره ای که نمونه به این سطح می رسد دوره استانه ( Cycle threshold) می نامند. سطح استانه و دوره استانه در انالیز دادهای مورد استفاده در سنجش ‘۵ نوکلئاز اهمیت ویژه ای دارند.

مقایسه Real Time PCR با  PCR معمولی:  Real Time PCR   توانایی تشخیص در مراحل اولیه واکنش یعنی مرحله نمایی را دارد در حالی که در روش PCR معمولی از ژل الکتروفورز در مراحل پایانی یعنی مر حله پلاتئو واکنش استفاده می شود.

محدودیت های نقطه پایانی PCR

به محض پیشرفت PCR، واکنشگرها تکثیر شده و مصرف می شوند. این کاهش در هر مرحله به نسبت مختلفی رخ خواهد داد. بنابراین نمونه ها از نظر مقداری بایکدیگر اختلاف پیدا خواهند کرد. این کاهش در مرحله خطی واکنش می باشد به همین دلیل حالت پلاتئو برای هر نمونه متفاوت خواهد بود. در حقیقت اگر اندازه گیری ها در مرحله پلاتئو انجام شود داده ها به درستی نمایان گر مقادیر اولیه در شروع واکنش نمی باشند. تشخیص بر اساس نقطه پایانی دقت و حساسیت پایین و قدرت تفکیک پذیری کم دارد.. نتایج این تشخیص در تعداد زیاد صدق نمی کند و به صورت خودکار نیز قابل اجرا نیست. تفکیک پذیری منحصرا بر اساس اندازه نیز از محدودیت های نقطه ی پایانی برای تشخیص میباشد.

کاربردهای  Real Time PCR

۱- تحقیقات میزان بیان mRNA .  ۲- اندازه گیری میزان همانند سازی DNA در ژنوم یا DNAهای ویروسی. ۳- میزان تأثیر دارو درمانی.  ۴- سنجش آسیب های .DNA  ۵- تشخیص عوامل بیماری زا.  ۶- تعیین ژنوتیپ افراد. ۷-سنجش تفکیک شدن آللی.

نتیجه گیری:

نتایجReal time PCR  سریع و دقیق بدست می اید در این روش از مرحله نمایی واکنش برای تشخیص استفاده می شود که مزیت هایی را نسبت به مرحله پلاتئو که در روش معمولی استفاده می شود دارد . محدوده دینامیکی تشخیص افزایش می یابد و نیز نیازی به سرعت و عجله در انجام پروسه PCR  نمی باشد. این تکنیک قدرت تفکیک پذیری بالای دارد به طوری که قادر به تشخیص تغییرات کمتر از دو فولد نیز می باشد. در حالی تفکیک پذیری ژل آگارز بسیار ضعیف می باشد. این روش برای ارزیابی مقادیر دقیقی از DNA و RNA  استفاده می شود در ضمن دشواری های روش معمولی را ندارد.

مجید پسندیده ۱، محمد رضا محمدآبادی ۲

۱-دانشجوی دوره کارشناسی ارشد ژنتیک و اصلاح نژاد دانشگاه شهید باهنر کرمان

۲- عضو هیئت علمی دانشگاه شهید باهنر کرمان

http://molecularmicrobiology.persianblog.ir

Reference

۱- Bachmann, M.H., Mathiason-Dubard, C., Learn, G.H., Rodrigo, A.G., Sodora, D.L., Mazzetti, P., Hoover, E.A., and Mullins, J.I. 200. Genetic diversity of feline immunodeficiency virus: dual infection, recombination, and distinct evolutionary rates among envelope sequence clades. J  irol 71, 4241-53.

۲-. Belgrader, P., Okuzumi, M., Pourahmadi, F., Borkholder, D.A., and Northrup, M.A. 2001. A microfluidic cartridge to prepare spores for PCR analysis. Biosens Bioelectron 14,

۸۴۹-۵۲.

۳- Chiang, P.W., Song, W.J., Wu, K.Y., Korenberg, J.R., Fogel, E.J., Van Keuren, M.L.,Lashkari, D., and Kurnit, D.M. 1996. Use of a fluorescent-PCR reaction to detect genomic sequence copy number and transcriptional abundance. Genome Res 6, 1013-26.

۴- Belgrader, P., Benett, W., Hadley, D., Long, G., Mariella, R., Jr., Milanovich, F., Nasarabadi, S., Nelson, W., Richards, J., and Stratton, P. 1998a. Rapid pathogen detection using a microchip PCR array instrument. Clin Chem 44, 2191-4.